Métodos no virales

Estos métodos presentan ciertas ventajas sobre los métodos virales, tales como facilidades de producción a gran escala y baja inmunogenicidad. Anteriormente, los bajos niveles de transfección y expresión del gen mantenían a los métodos no virales en una situación menos ventajosa; sin embargo, los recientes avances en la tecnología de vectores han producido moléculas y técnicas de transfección con eficiencias similares a las de los virus.
ADN desnudo
Éste es el método más simple de la transfección no viral. Consiste en la inyección intramuscular de por ejemplo, un plásmido con ADN desnudo. Varios de estos ensayos dieron resultados exitosos[cita requerida]. Sin embargo, la expresión ha sido muy baja en comparación con otros métodos de transformación. Además de los ensayos con plásmidos, se han realizado ensayos con productos de PCR, y se ha obtenido un éxito similar o superior. Este logro, sin embargo, no supera a otros métodos, lo que ha llevado a una investigación con métodos más eficientes de transformación, tales como la electroporación, sonoparción, o el uso de la biobalística, que consiste en disparar partículas de oro recubiertas de ADN hacia la célula utilizando altas presiones de gas.
Oligonucleótidos
El uso de oligonucleótidos sintéticos en la terapia génica tiene como objetivo la inactivación de los genes implicados en el proceso de la enfermedad.
Existen varias estrategias para el tratamiento con oligonucleótidos
Una estrategia, la terapia "antisentido" utiliza oligonucleótidos con la secuencia complementaria al RNAm del gen diana, lo que activa un mecanismo de silenciamiento génico. También se puede usar para alterar la transcripción del gen defectuoso, modificando por ejemplo su patrón de edición de intrones y exones.
Otra, hace uso de moléculas pequeñas de RNAi para señalar la célula a la que se adhieren secuencias específicas y únicas en la transcripción de ARN mensajero de un gen defectuoso, alterando la traducción de los ARNm defectuosos, y por tanto la expresión del gen. Otra estrategia utiliza oligodesoxinucleótidos como un señuelo para los factores de transcripción que se requieren en la activación de la transcripción de los genes objetivo. Los factores de transcripción se unen a los señuelos en lugar de al promotor del gen defectuoso, lo que reduce la transcripción de los genes objetivo, y de expresión. Además, oligonucleótidos de ADN de una sola cadena, han sido utilizados para dirigir el cambio de un única base dentro de un gen mutante.
Lipoplexes y poliplexes
Para mejorar la introducción de un nuevo ADN en la célula, éste debe ser protegido de cualquier daño y su entrada en la célula debe estar facilitada. Para este fin, nuevas moléculas, como liposomas y polisomas han sido creadas, y tienen la habilidad de proteger el ADN de la degradación durante el proceso de transfección. El ADN de plásmidos, puede ser cubierto por lípidos formando una estructura organizada, como una micela o un liposoma. Cuando la estructura organizada forma un complejo con el ADN entonces se denomina lipoplexe. Hay tres tipos de lípidos: aniónicos (cargados negativamente), neutros, o catiónicos (cargados positivamente). Inicialmente, lípidos aniónicos y neutros eran utilizados en la construcción de lipoplexes para vectores sintéticos. Sin embargo, estos son relativamente tóxicos, incompatibles con fluidos corporales y presentan la posibilidad de adaptarse a estar en un tejido específico. Además, son complicados y requieren tiempo para producirlos, por lo que la atención se dirigió a las versiones catiónicas. Los lípidos catiónicos, debido a su carga positiva, fueron los primeros usados para condensar negativamente moléculas de ADN cargadas, de tal forma que facilitara el encapsular ADN en liposomas. Más tarde, se constató que el uso de lípidos catiónicos mejoraba la estabilidad de los lipoplexes. Además, como resultado de su carga, los liposomas catiónicos interactúan con la membrana celular, y la endocitosis se cree que es la principal vía por la que las células absorben los lipoplexes. Los endosomas se forman como resultado de la endocitosis. Sin embargo, si los genes no pueden liberarse al citoplasma por rotura de la membrana del endosoma, los liposomas y el ADN contenido serán destruidos antes de que los genes puedan lograr sus funciones. También se averiguó que aunque lípidos catiónicos por ellos mismos podían condensar y encapsular ADN en los liposomas, la transfección eficiente es baja, debido a la falta de habilidad en el “escape endosomal”. Sin embargo, cuando “lípidos de ayuda” (normalmente lípidos electroneutrales, tales como DOPE) fueron añadidos para formar lipoplexes, se observó una transfección eficiente. Posteriormente, fue descubierto que ciertos lípidos tienen la capacidad de desestabilizar la membrana del endosoma, para facilitar la fuga del ADN, y estos lípidos se denominaron lípidos fusogénicos. Aunque liposomas catiónicos han sido utilizados como una alternativa para la entrega de genes en los vectores, la dosis depende de la toxicidad de los lípidos catiónicos, y se observó que podrían limitar sus funciones terapéuticos. El uso más común de los lipoplexes ha sido en la transferencia de genes en las células cancerosas, donde los genes suministrados han activado los genes supresores del tumor en la célula y han disminuido la actividad de los oncogenes. Estudios recientes han mostrado que lipoplexes son útiles en las células epiteliales del sistema respiratorio, por lo que pueden ser utilizados para el tratamiento genético de las enfermedades respiratorias como la fibrosis quística. Los complejos de polímeros de ADN se denominan poliplexes y la mayoría consisten en polímeros catiónicos, regulados por interacciones iónicas. Una gran diferencia entre los métodos de acción de poliplexes y lipoplexes es que poliplexes no pueden liberar su ADN cargado al citoplasma.
Métodos híbridos
Debido a muchos métodos de transferencia de genes que presentan deficiencias, se han desarrollado algunos métodos híbridos que combinan dos o más técnicas. Los virosomas son un ejemplo, y combinan liposomas con el virus inactivado VIH o el virus de la gripe. Esto ha demostrado tener mayor transferencia de genes eficientes en células epiteliales del sistema respiratorio, que cualquier otro método vírico o liposomal. Otros métodos implicados mezclan vectores víricos con lípidos catiónicos o virus hibridados.
Dendrímeros
Un dendrímero es una macromolécula muy ramificada con forma esférica. La superficie de la partícula puede ser funcional de muchas formas y algunas de sus propiedades derivadas de su construcción están determinados por su superficie. En particular, es posible construir un dendrímero catiónico, es decir, con carga superficial positiva. Con la presencia de material genético como ADN o ARN, dirigen su carga complementaria para la asociación del ácido nucleico con el dendrímero catiónico. Al llegar a su destino, el complejo dendrímero-ácido nucleico es entonces tomado por la célula a través de endocitosis. Los dendrímeros ofrecen construcciones covalentes, robustas y un control extremo sobre la estructura de la molécula. En conjunto, presentan más ventajas que los lípidos catiónicos. La producción de dendrímeros ha sido históricamente un proceso ralentizado y caro, que consta de numerosas reacciones lentas, un obstáculo que agrava su desarrollo comercial. La empresa Dendritic Nanotechnologies, con sede en Michigan , descubrió un método para producir dendrímeros utilizando la cinética química, un proceso que no solo reduce costes en una magnitud de tres, sino que también acorta las reacciones de un mes, a varios días. Estos nuevos dendrímeros “Priostar” pueden ser construidos específicamente para transportar una carga útil de ADN o ARN que transfiere a las células en una alta eficiencia y con una escasa o nula toxicidad.
Vacunas de ADN
Como todas las vacunas se busca la expresión de unas proteínas virales determinadas a las que pretendemos provocar una respuesta inmune.
En un principio las vacunas consistían en virus atenuados, lo que presentaba un cierto riesgo de biopeligrosidad. Una segunda generación de vacunas consistían en la introducción de proteínas que producen una respuesta inmune alta.
Actualmente están en desarrollo las vacunas con ADN, que son más seguros y eficaces que los virus atenuados. Además son más fáciles de transportar. El único riesgo existente es que puedan llegar a integrar en el genoma. Se está experimentando en algunas enfermedades como el VIH, la malaria y el cancer, administrándolos en forma de liposomas, inyecciones o biobalistica.