La gran diversidad de situaciones en las que podría aplicarse la terapia génica hace imposible la existencia de un solo tipo de vectoradecuado. Sin embargo, pueden definirse las siguientes características para un "vector ideal" y adaptarlas luego a situaciones concretas:
• Que sea reproducible.
• Que sea estable.
• Que permita la inserción de material genético sin límite de tamaño.
• Que permita la transducción tanto en células en división como en aquellas que no están proliferando.
• Que posibilite la integración específica del gen terapéutico.
• Que reconozca y actúe sobre células específicas.
• Que la expresión del gen terapéutico pueda ser regulada.
• Que carezca de elementos que induzcan una respuesta inmune.
• Que pueda ser caracterizado completamente.
• Que sea inocuo o que sus posibles efectos secundarios sean mínimos.
• Que sea fácil de producir y almacenar.
• Que todo el proceso de su desarrollo tenga un coste razonable.
Los vectores van a contener los elementos que queramos introducir al paciente, que no van a ser sólo los genes funcionales, sino también elementos necesarios para su expresión y regulación, como pueden ser promotores, potenciadores o secuencias específicas que permitan su control bajo ciertas condiciones.
Podemos distinguir dos categorías principales en vectores usados en terapia génica: virales y no virales.
Virus
Todos los virus son capaces de introducir su material genético en la célula huésped como parte de su ciclo de replicación. Gracias a ello, pueden producir más copias de sí mismos, e infectar a otras células.
Algunos tipos de virus insertan sus genes físicamente en el genoma del huésped, otros pasan por varios orgánulos celulares en su ciclo de infección y otros se replican directamente en el citoplasma, por lo que en función de la terapia a realizar nos puede interesar uno u otro.
Retrovirus
El genoma de los retrovirus está constituido por RNA de cadena sencilla, en el cual se distinguen tres zonas claramente definidas: una intermedia con genes estructurales, y dos flanqueantes con genes y estructuras reguladoras. Cuando un retrovirus infecta a una célula huésped, introduce su ARN junto con algunas enzimas que se encuentran en la matriz, concretamente una proteasa, una [[Transcriptasa inversa|transcriptasa inversa] y una integrasa.
La acción de la retrotranscriptasa permite la síntesis del DNA genómico del virus a partir del RNA. A continuación, la integrasa introduce este DNA en el genoma del huésped. A partir de este punto, el virus puede permanecer latente o puede activar la replicación masivamente.
Para usar los retrovirus como vectores víricos para terapia génica se eliminan los genes responsables de su replicación y se reemplazan estas regiones por el gen a introducir seguido de un gen marcador.
Del genoma vírico quedan las secuencias LTR y los elementos necesarios para producir los vectores a gran escala y para transformar las células son aportados desde otros vectores, bien plasmídicos o bien en lineas celulares específicas. En el caso de usar vectores plasmídicos, estrategias como cotransformar con varios plásmidos distintos que codifiquen para las proteínas del retrovirus, y que la transcripción de sus secuencias esté sometida a promotores eucariotas puede contribuir a minimizar el riesgo de que por recombinación se generen virus recombinantes.
Últimamente se está estudiando el uso de vectores que auto-inactivan sus secuencias LTRs una vez se han integrado en el genoma de la célula diana. Esto evita que se empaqueten las secuencias integradas en el caso de que se produjera en el organismo una infección por retrovirus, con la consecuente dispersión del virus que hay integrado por el organismo y su infección a otras células no específicas.
Una vez que el material genético del retrovirus se incorpora y se ha convertido en parte del material genético de la célula huésped, si esta se divide después, sus descendientes contendrán todos los nuevos genes. Aunque algunas veces los genes de los retrovirus no se expresan inmediatamente. Uno de los problemas de la terapia génica con la utilización de retrovirus es que la enzima integrasa puede insertar material genético de los retrovirus en posiciones arbitrarias en el genoma del huésped, y si el material genético se inserta en medio de un gen original, este gen se verá perturbado (mutagénesis de inserción). Si por ejemplo, el gen regula la división de la célula, ésta se verá descontrolada. Ensayos de terapia génica utilizando vectores retrovirales para tratar la inmunodeficiencia combinada grave ligada al cromosoma X (X-SCID) representan la aplicación más exitosa de la terapia hasta la fecha. Así, más de veinte pacientes han sido tratado en Francia y Gran Bretaña, con una alta tasa de reconstitución del sistema inmunitario. Sin embargo, ensayos similares fueron restringidos en los Estados Unidos cuando se informó de la aparición de leucemia en pacientes. Hasta hoy se conocen cuatro casos de niños franceses y uno británico que han desarrollado leucemia como resultado de mutagénesis por inserción de los vectores retrovirales, y todos menos uno de estos niños respondieron bien al tratamiento convencional contra la leucemia. En la actualidad, la terapia génica para tratar SCID continúa siendo exitosa en USA, Gran Bretaña, Italia y Japón.
Adenovirus
Son virus cuyo material genético se encuentra en forma de doble cadena de ADN. Causan infecciones humanas respiratorias, intestinales y otras que afectan a los ojos (especialmente el resfriado común). Cuando estos virus introducen su ADN, éste no es integrado normalmente en los cromosomas de la célula huésped.
La molécula de ADN permanece libre en el núcleo celular y se transcribe de forma independiente. Esto supone una ventaja ya que uno de los efectos colaterales de la terapia génica es la inserción de los vectores en zonas aleatorias de los cromosomas de la célula huésped, lo que puede conducir a la mutagénesis por inserción en un gen celular importante, o a la no expresión de nuestro gen introducido, por integrarse este en una zona del genoma que no se exprese.
A los vectores basados en adenovirus se les eliminan los genes de replicación y encapsidación, por lo que para producirlos en grandes cantidades necesitamos de líneas celulares modificadas que les aporten los productos de esos genes, o virus helpers, que sí tengan esas proteínas.
Otra ventaja de los adenovirus es que infectan tanto células en proliferación como células quiescentes. No obstante, los adenovirus producen una fuerte respuesta inmune.
Virus Adenoasociados (VAA)
Son pequeños virus con un genoma de ADN monocatenario. Pueden insertar material genético en un lugar específico en el cromosoma 19, con casi un 100% de certeza. Sin embargo, el VAA recombinante, que no contiene ningún gen viral, solo el gen terapéutico, no se integra en el genoma. En su lugar, el genoma vírico recombinante fusiona sus extremos a través del ITR (repeticiones terminales invertidas), apareciendo recombinación de la forma circular y episomal que se predice que pueden ser la causa de la expresión génica a largo plazo. Podemos encontrar ciertas desventajas con la utilización del VAA, como la pequeña cantidad de ADN que puede llevar (baja capacidad) y la dificultad en su elaboración. Este tipo de virus está siendo utilizado, sin embargo, porque es un virus no patógeno (la mayoría de las personas son portadoras de este virus inofensivo). A diferencia de los adenovirus, en la mayoría de los pacientes tratados con VAA no aparecen respuestas inmunes para eliminar el virus ni las células con las que han sido tratados. Muchos ensayos con VAA están en curso o en preparación, principalmente en el tratamiento de músculos y enfermedades oculares, los dos tejidos donde el virus parece ser particularmente útil. Sin embargo, se están comenzando a realizar pruebas clínicas, donde vectores del VAA son utilizados para introducir los genes en el cerebro. Esto es posible porque VAA pueden infectar células quiescentes (que no se dividen), tales como las neuronas.
Herpes virus
Son virus de ADN cuyas células diana son las neuronas. Su complejidad y lo poco que todavía conocemos de esta familia de virus, dificulta su utilización. La gran ventaja es el gran tamaño de su ADN, que les permite aceptar varios genes terapéuticos. Uno de los inconvenientes es que habría que eliminar las secuencias que codifican las proteínas líticas del virus que causa la muerte de las células a las que infecta.
Proteína "pseudotyping" de vectores virales
Los vectores virales descritos anteriormente tienen poblaciones naturales de células huésped que ellos infectan de manera eficiente. Los retrovirus presentan limitados los tipos naturales de hospedadores, y aunque los adenovirus y virus adeno-asociados son capaces de infectar a un amplio rango de células de manera eficiente, algunos tipos de células son refractarias a la infección por estos virus. El ataque para entrar en una célula está mediado por la proteína de envoltura de la superficie de un virus. Los retrovirus y virus adeno-asociados tienen una única proteína de revestimiento en la membrana, mientras que lo adenovirus están recubiertos con una envoltura de proteínas y fibras que se extiende fuera de la superficie del mismo. La envoltura de proteínas de cada uno de estos virus se une a las moléculas de la superficie de la célula, tales como heparina, la cual se localiza sobre la superficie de células hospedadoras potenciales, así como proteínas específicas de receptor que también induce a cambios estructurales en la proteína del virus, o localiza el virus en endosomas, donde la acidificación le lleva a éste a replegar su revestimiento. En cualquier caso, la entrada en las células huésped requiere una interacción favorable entre una proteína de la superficie del virus, y una proteína de la superficie de la célula. Por la finalidad de la terapia génica, se podría limitar o expandir el rango de células susceptibles a la transducción por un vector de la terapia génica. Por ello, se han desarrollado muchos vectores, en los cuales la cubierta vírica de proteínas ha sido remplazada por otros revestimientos proteicos de otros virus, o por proteínas quiméricas. Esta quimera constará de las partes de la proteína vírica necesaria para su incorporación en el virión, así como las secuencias, supuestamente, a interacturar con receptores específicos de proteínas celulares. Los virus en los cuales el revestimiento proteico ha sido remplazado como se ha descrito, son denominados virus pseudotyped. Por ejemplo, el vector más popular retrovírico para el uso en pruebas de terapia génica ha sido el lentivirus, virus de la inmunodeficiencia de Simian, revestido con la cubierta de proteínas G del virus de la estomatitis vesicular. Este vector se conoce como VSV y puede infectar a casi todas las células, gracias a la proteína G con la cual este vector es revestido. Se han hecho muchos intentos para limitar el tropismo (capacidad de infectar a muchas células) de los vectores virales para una o varias poblaciones de una célula huésped. Este avance podría permitir la administración sistemática de una cantidad relativamente pequeña del vector. La mayoría de los intentos han utilizado proteínas quiméricas para la envuelta, la cuales incluían fragmentos de anticuerpos. Así, estos vectores pseudotyped parecen ser una gran promesa para el descubrimiento de la “bala mágica” en las terapias génicas.
• Que sea reproducible.
• Que sea estable.
• Que permita la inserción de material genético sin límite de tamaño.
• Que permita la transducción tanto en células en división como en aquellas que no están proliferando.
• Que posibilite la integración específica del gen terapéutico.
• Que reconozca y actúe sobre células específicas.
• Que la expresión del gen terapéutico pueda ser regulada.
• Que carezca de elementos que induzcan una respuesta inmune.
• Que pueda ser caracterizado completamente.
• Que sea inocuo o que sus posibles efectos secundarios sean mínimos.
• Que sea fácil de producir y almacenar.
• Que todo el proceso de su desarrollo tenga un coste razonable.
Los vectores van a contener los elementos que queramos introducir al paciente, que no van a ser sólo los genes funcionales, sino también elementos necesarios para su expresión y regulación, como pueden ser promotores, potenciadores o secuencias específicas que permitan su control bajo ciertas condiciones.
Podemos distinguir dos categorías principales en vectores usados en terapia génica: virales y no virales.
Virus
Todos los virus son capaces de introducir su material genético en la célula huésped como parte de su ciclo de replicación. Gracias a ello, pueden producir más copias de sí mismos, e infectar a otras células.
Algunos tipos de virus insertan sus genes físicamente en el genoma del huésped, otros pasan por varios orgánulos celulares en su ciclo de infección y otros se replican directamente en el citoplasma, por lo que en función de la terapia a realizar nos puede interesar uno u otro.
Retrovirus
El genoma de los retrovirus está constituido por RNA de cadena sencilla, en el cual se distinguen tres zonas claramente definidas: una intermedia con genes estructurales, y dos flanqueantes con genes y estructuras reguladoras. Cuando un retrovirus infecta a una célula huésped, introduce su ARN junto con algunas enzimas que se encuentran en la matriz, concretamente una proteasa, una [[Transcriptasa inversa|transcriptasa inversa] y una integrasa.
La acción de la retrotranscriptasa permite la síntesis del DNA genómico del virus a partir del RNA. A continuación, la integrasa introduce este DNA en el genoma del huésped. A partir de este punto, el virus puede permanecer latente o puede activar la replicación masivamente.
Para usar los retrovirus como vectores víricos para terapia génica se eliminan los genes responsables de su replicación y se reemplazan estas regiones por el gen a introducir seguido de un gen marcador.
Del genoma vírico quedan las secuencias LTR y los elementos necesarios para producir los vectores a gran escala y para transformar las células son aportados desde otros vectores, bien plasmídicos o bien en lineas celulares específicas. En el caso de usar vectores plasmídicos, estrategias como cotransformar con varios plásmidos distintos que codifiquen para las proteínas del retrovirus, y que la transcripción de sus secuencias esté sometida a promotores eucariotas puede contribuir a minimizar el riesgo de que por recombinación se generen virus recombinantes.
Últimamente se está estudiando el uso de vectores que auto-inactivan sus secuencias LTRs una vez se han integrado en el genoma de la célula diana. Esto evita que se empaqueten las secuencias integradas en el caso de que se produjera en el organismo una infección por retrovirus, con la consecuente dispersión del virus que hay integrado por el organismo y su infección a otras células no específicas.
Una vez que el material genético del retrovirus se incorpora y se ha convertido en parte del material genético de la célula huésped, si esta se divide después, sus descendientes contendrán todos los nuevos genes. Aunque algunas veces los genes de los retrovirus no se expresan inmediatamente. Uno de los problemas de la terapia génica con la utilización de retrovirus es que la enzima integrasa puede insertar material genético de los retrovirus en posiciones arbitrarias en el genoma del huésped, y si el material genético se inserta en medio de un gen original, este gen se verá perturbado (mutagénesis de inserción). Si por ejemplo, el gen regula la división de la célula, ésta se verá descontrolada. Ensayos de terapia génica utilizando vectores retrovirales para tratar la inmunodeficiencia combinada grave ligada al cromosoma X (X-SCID) representan la aplicación más exitosa de la terapia hasta la fecha. Así, más de veinte pacientes han sido tratado en Francia y Gran Bretaña, con una alta tasa de reconstitución del sistema inmunitario. Sin embargo, ensayos similares fueron restringidos en los Estados Unidos cuando se informó de la aparición de leucemia en pacientes. Hasta hoy se conocen cuatro casos de niños franceses y uno británico que han desarrollado leucemia como resultado de mutagénesis por inserción de los vectores retrovirales, y todos menos uno de estos niños respondieron bien al tratamiento convencional contra la leucemia. En la actualidad, la terapia génica para tratar SCID continúa siendo exitosa en USA, Gran Bretaña, Italia y Japón.
Adenovirus
Son virus cuyo material genético se encuentra en forma de doble cadena de ADN. Causan infecciones humanas respiratorias, intestinales y otras que afectan a los ojos (especialmente el resfriado común). Cuando estos virus introducen su ADN, éste no es integrado normalmente en los cromosomas de la célula huésped.
La molécula de ADN permanece libre en el núcleo celular y se transcribe de forma independiente. Esto supone una ventaja ya que uno de los efectos colaterales de la terapia génica es la inserción de los vectores en zonas aleatorias de los cromosomas de la célula huésped, lo que puede conducir a la mutagénesis por inserción en un gen celular importante, o a la no expresión de nuestro gen introducido, por integrarse este en una zona del genoma que no se exprese.A los vectores basados en adenovirus se les eliminan los genes de replicación y encapsidación, por lo que para producirlos en grandes cantidades necesitamos de líneas celulares modificadas que les aporten los productos de esos genes, o virus helpers, que sí tengan esas proteínas.
Otra ventaja de los adenovirus es que infectan tanto células en proliferación como células quiescentes. No obstante, los adenovirus producen una fuerte respuesta inmune.
Virus Adenoasociados (VAA)
Son pequeños virus con un genoma de ADN monocatenario. Pueden insertar material genético en un lugar específico en el cromosoma 19, con casi un 100% de certeza. Sin embargo, el VAA recombinante, que no contiene ningún gen viral, solo el gen terapéutico, no se integra en el genoma. En su lugar, el genoma vírico recombinante fusiona sus extremos a través del ITR (repeticiones terminales invertidas), apareciendo recombinación de la forma circular y episomal que se predice que pueden ser la causa de la expresión génica a largo plazo. Podemos encontrar ciertas desventajas con la utilización del VAA, como la pequeña cantidad de ADN que puede llevar (baja capacidad) y la dificultad en su elaboración. Este tipo de virus está siendo utilizado, sin embargo, porque es un virus no patógeno (la mayoría de las personas son portadoras de este virus inofensivo). A diferencia de los adenovirus, en la mayoría de los pacientes tratados con VAA no aparecen respuestas inmunes para eliminar el virus ni las células con las que han sido tratados. Muchos ensayos con VAA están en curso o en preparación, principalmente en el tratamiento de músculos y enfermedades oculares, los dos tejidos donde el virus parece ser particularmente útil. Sin embargo, se están comenzando a realizar pruebas clínicas, donde vectores del VAA son utilizados para introducir los genes en el cerebro. Esto es posible porque VAA pueden infectar células quiescentes (que no se dividen), tales como las neuronas.Herpes virus
Son virus de ADN cuyas células diana son las neuronas. Su complejidad y lo poco que todavía conocemos de esta familia de virus, dificulta su utilización. La gran ventaja es el gran tamaño de su ADN, que les permite aceptar varios genes terapéuticos. Uno de los inconvenientes es que habría que eliminar las secuencias que codifican las proteínas líticas del virus que causa la muerte de las células a las que infecta.
Proteína "pseudotyping" de vectores virales
Los vectores virales descritos anteriormente tienen poblaciones naturales de células huésped que ellos infectan de manera eficiente. Los retrovirus presentan limitados los tipos naturales de hospedadores, y aunque los adenovirus y virus adeno-asociados son capaces de infectar a un amplio rango de células de manera eficiente, algunos tipos de células son refractarias a la infección por estos virus. El ataque para entrar en una célula está mediado por la proteína de envoltura de la superficie de un virus. Los retrovirus y virus adeno-asociados tienen una única proteína de revestimiento en la membrana, mientras que lo adenovirus están recubiertos con una envoltura de proteínas y fibras que se extiende fuera de la superficie del mismo. La envoltura de proteínas de cada uno de estos virus se une a las moléculas de la superficie de la célula, tales como heparina, la cual se localiza sobre la superficie de células hospedadoras potenciales, así como proteínas específicas de receptor que también induce a cambios estructurales en la proteína del virus, o localiza el virus en endosomas, donde la acidificación le lleva a éste a replegar su revestimiento. En cualquier caso, la entrada en las células huésped requiere una interacción favorable entre una proteína de la superficie del virus, y una proteína de la superficie de la célula. Por la finalidad de la terapia génica, se podría limitar o expandir el rango de células susceptibles a la transducción por un vector de la terapia génica. Por ello, se han desarrollado muchos vectores, en los cuales la cubierta vírica de proteínas ha sido remplazada por otros revestimientos proteicos de otros virus, o por proteínas quiméricas. Esta quimera constará de las partes de la proteína vírica necesaria para su incorporación en el virión, así como las secuencias, supuestamente, a interacturar con receptores específicos de proteínas celulares. Los virus en los cuales el revestimiento proteico ha sido remplazado como se ha descrito, son denominados virus pseudotyped. Por ejemplo, el vector más popular retrovírico para el uso en pruebas de terapia génica ha sido el lentivirus, virus de la inmunodeficiencia de Simian, revestido con la cubierta de proteínas G del virus de la estomatitis vesicular. Este vector se conoce como VSV y puede infectar a casi todas las células, gracias a la proteína G con la cual este vector es revestido. Se han hecho muchos intentos para limitar el tropismo (capacidad de infectar a muchas células) de los vectores virales para una o varias poblaciones de una célula huésped. Este avance podría permitir la administración sistemática de una cantidad relativamente pequeña del vector. La mayoría de los intentos han utilizado proteínas quiméricas para la envuelta, la cuales incluían fragmentos de anticuerpos. Así, estos vectores pseudotyped parecen ser una gran promesa para el descubrimiento de la “bala mágica” en las terapias génicas.
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